DRL

Daniela Rebolledo López

La Dra. Rebolledo recibió su título de Bioquímico de la Pontificia Universidad Católica de Chile en el año 2008. En el año 2013 recibió su grado de Doctor en Química de la misma casa de estudios.


Líneas de Investigación

Papel de la enzima nNOSµ en la función y patología del músculo esquelético.

La Óxido Nítrico Sintasa neuronal (nNOS) es una enzima que sintetiza óxido nítrico (NO). De al menos 4 variantes de splicing, nNOSμ es la isoforma expresada específicamente en músculo esquelético y cardiaco. nNOSμ se localiza en el sarcolema por interacción con el complejo de proteínas asociada a la distrofina, donde la principal función descrita es la oposición a la vasoconstricción durante el ejercicio, manteniendo niveles de oxígeno adecuados para el funcionamiento del músculo.
La expresión y localización sarcolemal de nNOSμ se encuentra afectada la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) y su modelo animal el ratón mdx, causada por mutaciones en el gen de la distrofina. Interesantemente, la localización de la enzima también se pierde en varios desórdenes neuromusculares no relacionados con la distrofina, incluyendo esclerosis lateral amiotrófica, otras distrofias musculares, daño por denervación, atrofia por desuso y envejecimiento.

La opción terapéutica de incrementar los niveles de nNOSμ sin recuperar su localización sarcolemal se ha convertido en un tema controversial debido a evidencias que indican un posible efecto tóxico de nNOSμ lozalizada en el citosol. Por esto, mi tesis de doctorado tuvo como objetivo evaluar la hipótesis de que la expresión de la proteína nNOSμ es capaz de mejorar la función muscular en el ratón mdx en forma dependiente de su localización. Para esto, se clonó nNOSμ y se generaron 2 ratones transgénicos. El primer transgénico expresa la isoforma muscular nNOSμ, que en el contexto del ratón mdx no puede localizarse en el sarcolema y se mantiene en el citosol. El segundo, expresa nNOSμ con un tag de destinación a la membrana plasmática; en el ratón mdx, la proteína producto del transgen puede localizarse en el sarcolema en forma independiente de la expresión de distrofina. Experimentos funcionales indican que NOSμ localizada en el sarcolema disminuye la fatiga y el daño por contracción eccéntrica en músculo esquelético del ratón mdx, mientras que nNOSμ localizada en el citosol provoca un aumento en la susceptibilidad a la fatiga en el diafragma del ratón mdx. Los resultados de mi tesis doctoral enfatizan la importancia de la localización sarcolemal de nNOSμ y apoyarían la hipótesis de ganancia de función tóxica de la enzima cuando está deslocalizada.
Estos resultados fueron publicados en: Human Molecular Genetics. 2016 Jan;25(1):158-66.

Estos son los primeros transgénicos generados que expresan la isoforma muscular (μ) de nNOS; la comparación con la isoforma neuronal α permitirá obtener claves del papel que cumplen los 34 aá adicionales que conforman el dominio μ. Por otro lado, la localización sarcolemal de nNOSμ independiente de distrofina abre la posibilidad de estudio de las funciones de esta enzima en modelos de otras enfermedades musculares donde se encuentra deslocalizada.

Actualmente, en mi fondecyt de inicio (11181090), estoy enfocada en estudiar el rol de esta enzima en los procesos fibróticos asociados a patologías del músculo esquelético. La fibrosis es la acumulación de proteínas de matriz extracelular (MEC) que reemplazan el tejido contráctil, perdiendo la función muscular.
Lo que sabemos hasta ahora, es que mantener la localización de nNOSµ en el sarcolema disminuye citoquinas profibróticas y la acumulación de MEC en el músculo esquelético en el contexto de las distrofias musculares (ratones mdx) y en la fibrosis asociada a la denervación.

CTGF en fibrosis asociada a denervación.

Nosotros observamos que el músculo esquelético que ha perdido su comunicación con la neurona motora (denervación) aumentaba la cantidad de matriz extracelular, en un proceso fibrótico. La fibrosis es la acumulación de proteínas de matriz extracelular (MEC) que reemplazan el tejido contráctil, perdiendo la función muscular.
El factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) es una proteína matricelular con alto potencial profibrótico, la cual quisimos evaluar si estaba involucrada en la fibrosis asociada a la denervación. Con este propósito, usamos un modelo genético de reducción de CTGF (hemicigoto o CTGF+/-) y la inhibición de la actividad biológica con anticuerpos bloqueantes de CTGF en nuestro modelo de denervación. Nuestros resultados indican que CTGF participa en el desarrollo de fibrosis asociada a la denervación, y que bloquear su actividad reduce el fenotipo fibrótico.
Estos resultados fueron publicados en: Matrix Biology. 2019 Feb 1. pii: S0945-053X(18)30455-4. doi: 10.1016/j.matbio.2019.01.002.

En este mismo contexto hemos evaluado el rol de CTGF en la fibrosis asociada a la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), una enfermedad neurodegenerativa donde el músculo se denerva por la muerte de las motoneuronas. Hemos descrito que bloquear CTGF en un modelo de ELA mejora la función muscular y previene la denervación manteniendo los axones de las neuronas motoras.
Estos resultados fueron publicados en:
Human Molecular Genetics 2018 Aug 15;27(16):2913-2926.
PLoS One. 2017 May 16;12(5):e0177649.

Rol de Hipoxia en la fibrosis del músculo esquelético.

En condiciones de una baja concentración de oxígeno (hipoxia o isquemia) las células del músculo esquelético responden con una cascada de señales que llevan a que la célula se adapte a sobrevivir con menos oxígeno y genere estrategias para captar más oxígeno. Esta estrategia beneficiosa en un contexto de daño agudo, se convierte en un arma de doble filo cuando el daño es crónico. Así, diversos modelos de daño muscular tienen sobre expresada la vía de respuesta a hipoxia a través del factor de transcripción HIF-1α. HIF-1α es capaz de inducir la citoquina profibrótica CTGF, por lo que estamos estudiando cómo la respuesta hipóxica a través de HIF-1α promueve la fibrosis en patologías musculares, y cuáles son las células responsables de esta respuesta.

Publicaciones

    1. CTGF/CCN2 Modulates Denervation-induced Skeletal Muscle Fibrosis independently of TGF-β. Daniela L. Rebolledo, David González, Jennifer Faundez-Contreras, Osvaldo Contreras, Joanne E. Murphy-Ullrich, Kenneth E. Lipson and Enrique Brandan. Matrix Biology. 2019 Feb 1. pii: S0945-053X(18)30455-4. doi: 10.1016/j.matbio.2019.01.002.
    2. The inhibition of CTGF/CCN2 activity improves muscle and locomotor function in a murine ALS model. Gonzalez D, Rebolledo DL, Correa LM, Court F, Cerpa W, Lipson KE, van Zundert B, Brandan E. Human Molecular Genetics 2018 Aug 15;27(16):2913-2926.
    3. ALS skeletal muscle shows enhanced TGF-β signaling, fibrosis and induction of fibro/adipogenic progenitor markers. Gonzalez D, Contreras O, Rebolledo DL, Espinoza JP, van Zundert B, Brandan E. PLoS One. 2017 May 16;12(5):e0177649.
    4. Connective tissue cells expressing fibro/adipogenic progenitor markers increase under chronic damage: relevance in fibroblast-myofibroblast differentiation and skeletal muscle fibrosis. Contreras O, Rebolledo DL, Oyarzún JE, Olguín HC, Brandan E. Cell and Tissue Research. 2016 Jun;364(3):647-60. doi: 10.1007/s00441-015-2343-0.
    5. Sarcolemmal targeting of nNOSμ improves contractile function of mdx muscle. Rebolledo DL, Kim MJ, Whitehead NP, Adams ME, Froehner SC. Human Molecular Genetics. 2016 Jan 1;25(1):158-66.
    6. ACE2 is augmented in dystrophic skeletal muscle and plays a role in decreasing associated fibrosis. Riquelme C, Acuña MJ, Torrejón J, Rebolledo D, Cabrera D, Santos RA, Brandan E. PLoS One. 2014 Apr 2;9(4):e93449.
    7. Synaptic defects associated with s-inclusion body myositis are prevented by copper. Aldunate R, Minniti AN, Rebolledo D, Inestrosa NC. Biometals. 2012 Aug;25(4):815-24.
    8. Copper Reduces Aβ Oligomeric Species and Ameliorates Neuromuscular Synaptic Defects in a C. elegans Model of Inclusion Body Myiositis Daniela L. Rebolledo, Rebeca Aldunate, Rebecca Kohn, Iván Neira, Alicia N. Minniti, and Nibaldo C. Inestrosa. The Journal of Neuroscience. 2011 Jul 13;31(28):10149-58.
    9. Intracellular amyloid formation in muscle cells of Aβ-transgenic Caenorhabditis elegans: determinants and physiological role in copper detoxification. Alicia N. Minniti, Daniela L. Rebolledo, Paula M. Grez, Ricardo Fadic, Rebeca ALdunate, Irene Volitakis, Robert A. Cherny, Carlos Opazo, Colin Masters, Ashley I. Bush & Nibaldo C. Inestrosa. Molecular Neurodegeneration 2009 Jan 6;4(1):2.
    10. Inclusion Body Myositis, a View from the Caenorhabditis elegans Muscle. Rebolledo DL, Minniti AN, Grez PM, Fadic R, Kohn R, Inestrosa NC. Molecular Neurobiology 2008 Oct; 38(2):178-98. Epub 2008 Sep 5.
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